Синтез лекарственного вещества (пенициллина)

Синтез лекарственного вещества (пенициллина) Введение
Пенициллины являются первыми АМП, разработанными на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Они относятся к обширному классу β-лактамных антибиотиков (β-лактамов), который включает также цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы. Общим в структуре этих антибиотиков является четырехчленное β-лактамное кольцо. β-лактамы составляют основу современной химиотерапии, так как занимают ведущее или важное место в лечении большинства инфекций. Родоначальником пенициллинов (и вообще всех β-лактамов) является бензилпенициллин (пенициллин G, или просто пенициллин), применяющийся в клинической практике с начала 40-х годов. В настоящее время группа пенициллинов включает целый ряд препаратов, которые в зависимости от происхождения, химической структуры и антимикробной активности подразделяются на несколько подгрупп. Из природных пенициллинов в медицинской практике применяются бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин. Другие препараты представляют собой полусинтетические соединения, получаемые в результате химической модификации различных природных АМП или промежуточных продуктов их биосинтеза. Цель данной работы – рассмотреть синтез пенициллина. Задачи: дать характеристику пенициллина; выявить оборудование, реактивы; изучить вопросы техники безопасности. 1. Характеристика пенициллина
Пенициллин является антимикробным веществом, продуцируемым различными видами плесневого гриба пенициллиума (Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum и др.). В результате жизнедеятельности этих грибов образуются различные виды пенициллина. Один из наиболее активных - бензилпенициллин. Другие виды пенициллина отличаются от бензилпенициллина тем, что вместо бензильной группы содержат другие радикалы. Синонимы бензилпенициллина: Angicilline, Capicillin, Cilipen, Conspen, Cosmopen, Cracillin, Crystacillin, Crystapen, Deltapen, Dropeillin, Falapen, Lanacillin, Novopen, Penvlon, Pentallin, Pharmacillin, Pradupen, Rentopen, Rhinocillin, Solupen, Solvocillin, Supacillina, Veticillin и др. По химическому строению пенициллин представляет собой кислоту, из него могут быть получены различные соли (натриевая, калиевая и др.). Основой молекулы всех пенициллинов (пенициллиновым ядром) является 6-аминопеницилановая кислота - сложное гетероциклическое соединение, состоящее из двух колец: тиазолидинового и b-лактамного. В связи с наличием в молекуле пенициллинов b-лактамного кольца их относят к группе b-лактамных антибиотиков. Химическим путем получен ряд полусинтетических пенициллинов - производных 6-аминопенициллановой кислоты. Эта часть молекулы пенициллина малоактивна, но путем ацилирования и присоединения к ней различных химических групп удалось получить соединения, более стойкие и эффективные в отношении микроорганизмов (стафилококков), устойчивых к действию бензилпенициллина. В основе строения природных и синтетических пенициллинов лежит 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), в структуру которой входят два конден­сированных гетероцикла — азетидиновый и тиазолидиновый, имеющие об­щий атом азота: В молекуле пенициллина три асимметрических атома углерода — 3-, 5-, 6-й. Механизм действия пенициллинов связан с ингибированием биосинтеза белков клеточных стенок грамположительных бактерий (стрептококков, стафилококков, пневмококков). При этом происходит дезактивация клеточной транспептидазы, катализирующей поперечное сшивание белков. Фермент ошибоч­но принимает структуру пенициллина за дипептиды, составленные из ос-ами­нокислот — серина, цистеина и валина. Препараты группы пенициллина эффективны при инфекциях, вызванных грамположительными бактериями (стрептококками, стафилококками, пневмококками и др.), спирохетами и другими патогенными микроорганизмами. Они оказывают бактерицидное действие на микроорганизмы, находящиеся в фазе роста. Антибактериальный эффект связан со специфической способностью пенициллинов ингибировать биосинтез клеточной стенки микроорганизмов. Бензилпенициллин и другие препараты группы пенициллина неэффективны в отношении вирусов (возбудителей гриппа, полиомиелита, оспы и др.), микобактерий туберкулеза, возбудителя амебиаза, риккетсий, грибов, а также большинства патогенных грамотрицательных микроорганизмов. Между отдельными препаратами этой группы существуют различия в скорости наступления антибактериального действия, его продолжительности, эффективности при разных путях введения, способности накапливаться в разных органах и тканях, а также активности в отношении различных микроорганизмов. Так, новокаиновая соль бензилпенициллина и бициллин медленнее всасывается (при внутримышечном введении), но создают терапевтическую концентрацию в крови на более продолжительный срок, чем натриевая и калиевая соли бензилпенициллина; феноксиметилпенициллин, оксаллицин, ампициллин в отличие от других препаратов пенициллина эффективны при приеме внутрь. Характерной особенностью некоторых полусинтетических пенициллинов (оксаллицин и др.) является их эффективность в отношении штаммов микроорганизмов (стафилококков), резистентных к бензилпенициллину. Эта резистентность обусловлена способностью устойчивых штаммов микроорганизмов продуцировать специфические ферменты - бета-лактамазы (пенииллиназы), гидролизующие b-лактамное кольцо пенициллинов, что лишат их антибактериальной активности. В последнее время получены не только антибиотики, устойчивые к действию бета-лактамаз, но также соединения, разрушающие эти ферменты. Отдельные полусинтетические пенициллины так называемого широкого спектра действия (например, ампициллин) активны в отношении не только грамположительных, но и большинства грамотрицательных микроорганизмов (за исключением Pseudomonas aeruginosa). Активность препаратов пенициллина определяют биологическим путем по антибактериальному действию на определенный штамм золотистого стафилококка. За одну единицу действия (ЕД) принимают активность 0,5988 мкг химически чистой кристаллической натриевой соли бензилпенициллина. Длительное время пенициллины были основными антибиотиками, широко применявшимися в медицинской практике. Затем стали использовать также антибиотики других групп (тетрациклины, аминогликозиды и др.). В последние годы получен ряд антибиотиков - производных 7-аминоцефалоспорановой кислоты (цефалоспоринов и др.), расцениваемых в связи с широким спектром действия и высокой эффективностью как антибиотики новых поколений. Несмотря на наличие различных групп антибиотиков, а также новых высокоэффективных синтетических антибактериальных препаратов (особенно фторхинолонов), пенициллины продолжают занимать значительное место в терапии разных инфекционных болезней. Основными условиями выбора того или иного антибиотика являются определенная чувствительность к нему возбудителя и отсутствие противопоказаний к его назначению. 2. Оборудование
Прежде чем начать процесс ферментации, необходимо получить чистую высокопродуктивную культуру. Чистые культуры микроорганизмов хранят в очень небольших объемах и в условиях, обеспечивающих ее жизнеспособность и продуктивность; обычно это достигается хранением при низкой температуре. Ферментер может вмещать несколько сотен тысяч литров культуральной среды, и процесс начинают, вводя в нее культуру (инокулят), составляющей 1–10% объема, в котором будет идти ферментация. Таким образом, исходную культуру следует поэтапно (с пересеваниями) растить до достижения уровня микробной биомассы, достаточного для протекания микробиологического процесса с требуемой продуктивностью. Совершенно необходимо все это время поддерживать чистоту культуры, не допуская ее заражения посторонними микроорганизмами. Сохранение асептических условий возможно лишь при тщательном микробиологическом и химико-технологическом контроле. Промышленные микроорганизмы должны расти в ферментере при оптимальных для образования требуемого продукта условиях. Эти условия строго контролируют, следя за тем, чтобы они обеспечивали рост микроорганизмов и синтез продукта. Конструкция ферментера должна позволять регулировать условия роста – постоянную температуру, pH (кислотность или щелочность) и концентрацию растворенного в среде кислорода. Хотя промышленные микроорганизмы специально отбираются по своим генетическим свойствам так, чтобы выход желаемого продукта их метаболизма был максимален (в биологическом смысле), концентрация его все же мала по сравнению с той, которая достигается при производстве на основе химического синтеза. Поэтому приходится прибегать к сложным методам выделения – экстрагированию растворителем, хроматографии и ультрафильтрации. При проведении хроматографического процесса используют хроматограф, схема которого представлена на рис. 1. Установка и стабилизация потока и очистка газа-носителя выполняются системой подготовки газов (1). Дозирующее устройство (2) позволяет вводить в поток газа-носителя непосредственно перед колонкой определенное количество анализируемой смеси. В колонке (3) осуществляется разделение смеси на компоненты. 2

В хроматографии используются колонки трех типов; насадочные (набивные), микронасадочные и капиллярные. Насадочные колонки, стеклянные или металлические, имеют внутренний диаметр от 2 до 10 мм. Они наполняются твердым адсорбентом, покрытым тонкой пленкой нелетучей жидкости. Длина таких колонок, как правило, не превышает 4 м. Капиллярные колонки изготавливают из тонких капилляров (диаметром 0,25—0,5 м и длиной от 10 до 20 м). НФ в виде тонкой пленки наносится на стенки капилляров. а

б

1

3

6

4

5

7

8

Рис. 1. Схема хроматографа: 1 – система подготовки газов (а – баллон, б – регулятор потока), 2 – дозирующее устройство, 3 – колонки, 4 – детектор, 5 – терморегулятор, 6 – блок питания детектора, 7 – усилитель, 8 – самописец. Детектор (4) преобразует изменения каких-либо физических или физико-химических свойств смеси компонента с газом-носителем в сравнении с чистым газом-носителем в электрический сигнал. Детектор с блоком питания (6) составляет систему детектирования. Сигнал детектора, преобразованный усилителем (7), записывается регистрирующей системой (5) в виде хроматограмм. Необходимые температурные режимы колонки, детектора, дозирующего устройства достигаются помещением их в соответствующие термостаты, управляемые терморегулятором (5). Количественная обработка хроматограмм может производиться вручную или с помощью интегратора, автоматически фиксирующего площадь пика и время его выхода. 3. Реактивы
Способностью вырабатывать антибиотики обладают не все микроорганизмы, а лишь некоторые штаммы отдельных видов. Так, пенициллин образуют некоторые штаммы Penicillium notatum и P. chrysogenum, тогда как другие штаммы тех же видов либо вообще не вырабатывают антибиотики, либо вырабатывают, но другие. Существуют также различия между штаммами-продуцентами антибиотиков, причем эти различия могут быть количественными или качественными. Один штамм, например, дает максимальный выход данного антибиотика, когда культура растет на поверхности среды и находится в стационарных условиях, а другой – лишь когда его культура погружена в среду и постоянно встряхивается. Некоторые микроорганизмы выделяют не один, а несколько антибиотиков. Так, Pseudomonas aeruginosa образует пиоцианазу, пиоцианин, пиолипоевую кислоту и другие пио-соединения; Bacillus brevis производит грамицидин и тироцидин (смесь, известную под названием тиротрицин); P. notatum – пенициллин и пенатин; Aspergillus flavus – пенициллин и аспергилловую кислоту. Один и тот же антибиотик может продуцироваться микроорганизмами разного рода. 4. Установка
Обычный ферментер представляет собой закрытый цилиндрический резервуар, в котором механически перемешиваются среда и микроорганизмы. Через среду прокачивают воздух, иногда насыщенный кислородом. Температура регулируется с помощью воды или пара, пропускаемых по трубкам теплообменника. Такой ферментер с перемешиванием используется в тех случаях, когда ферментативный процесс требует много кислорода. Рис. 2. Ферментер 1 — корпус; 2 — паровая рубашка; 3 — барботёр; 4 — мешалка; 5 — отбойник; 6 — электропривод; 7 — загрузочный люк Уровень качества оборудования непосредственно влияет на эффективность его эксплуатации. Учитывая ключевое место ферментеров в технологической цепочке, их качество определяет эффективность всего производственного процесса. Если качество низкое, то резко возрастают простои оборудования в связи с ремонтом, последующей наладкой, ревалидацией, очисткой и стерилизацией. В сложных случаях, например, при выходе из строя важных узлов и деталей ферментера, которые требуется закупать у поставщика, их ожидание может затянуться на месяцы. Соответствие требованиям GMP , как важного показателя качества, исключительно важно. Причем, оно должно быть не по отдельным элементам, а концептуальным. Это должно быть и соответствие требованиям GMP всех материалов, контактирующих с продуктом, и применение автоматической мойки и стерилизации на месте ( CIP / SIP ), и валидируемость ( IQ / OQ ), и документирование процесса ферментации, и многое другое. 5. Ход синтеза
Пенициллины могут быть выделены из природных материалов биосинтетически или комбинацией методов биологического и химического синтеза. При промышленном производстве пенициллинов сначала получают амино-пенициллановую кислоту из культуры плесневого гриба, а затем микробиологическим или химическим спосо­бом проводят ацилирование аминогруппы карбоновой кислотой или ее хлорангидридом: При биосинтезе пенициллинов в питательную среду добавляют вещества-предшественники», которые используются плесневым грибом для замещения атома водорода в аминогруппе молекул пенициллинов. В частности, при про­изводстве бензилпенициллина предшественником служит фенилуксусная кис­лота или ее производные, для биосинтеза феноксиметилпенициллина — феноксиуксусная кислота и т.д. Однако не любой радикал может быть введен в молекулу пенициллинов таким способом. Исследование биосинтеза пенициллина с помощью меченых атомов позво­лило установить, что формирование молекулы осуществляется за счет содер­жащихся в питательной среде аминокислот (цистеина, валина) и соответству­ющих веществ-«предшественников». 6. Выделение конечного продукта
По завершении ферментации в бульоне присутствуют микроорганизмы, неиспользованные питательные компоненты среды, различные продукты жизнедеятельности микроорганизмов и тот продукт, который желали получить в промышленном масштабе. Поэтому данный продукт очищают от других составляющих бульона. Для удаления белка: обрабатывают солями алюминия, железа, цинка используют коагуляцию с танином термическая коагуляция (КЖ нагревают дл 65-70оС) Для очистки пенициллина используют экстракцию. Он, как кислота, хорошо растворим в органических растворителях, а в виде соли - в воде. Стадии выделения солей 1) стадия обезвоживания путем охлаждения до – 16-18оС с последующей фильтрацией льда. Удаление пигмента загрязнений - АУ. 2) Получается концентрат 0,6М КОН. РН=6,5, активность 150-250 тыс. Усл.ед/мл. 3) Стерилизующая функция и упаривание под вакуумом с добавлением бутанола (для смесей, кипящих при более низкой температуре (- 16-25оС) Калиевая соль пенициллина кристаллизуется. Ее фильтрат промывается бутанолом. Грануляция пасты и сушка в вакуум-сушильном шкафу при 75-80оС и 10 мм.рт.ст. 7. Техника безопасности
Среду необходимо стерилизовать, чтобы уничтожить все загрязняющие микроорганизмы. Сам ферментер и вспомогательное оборудование тоже стерилизуют. Существует два способа стерилизации: прямая инжекция перегретого пара и нагревание с помощью теплообменника. Желаемая степень стерильности зависит от характера процесса ферментации. Она должна быть максимальной при получении лекарственных препаратов и химических веществ. Требования же к стерильности при производстве алкогольных напитков менее строгие. О таких процессах ферментации говорят как о «защищенных», поскольку условия, которые создаются в среде, таковы, что в них могут расти только определенные микроорганизмы. Заключение
Антибиотики произвели революцию в лечебной практике. Среди многочисленных антибиотиков, широко применяемых в качестве химиотерапевтических средств, в наибольших количествах используются пенициллины, цефалоспорины, стрептомицин и другие аминогликозиды, хлорамфеникол, тетрациклины и эритромицин. Кроме того, важное значение имеют бацитрацин, полимиксин, неомицин, нистатин и гризеофульвин. В определенных случаях используют также и другие антибиотики. Пенициллин широко применяется в лечении стафилококковых инфекций – остеомиелита, инфекционного артрита, пневмонии, бронхита, эмпиемы, эндокардита, фурункулеза, ларинготрахеита, мастита, менингита, воспаления среднего уха, перитонита, инфицированных ран и ожогов, септицемии, синусита, тонзиллита и многих других заболеваний. Его с успехом используют при различных инфекциях, вызываемых гемолитическими и анаэробными стрептококками, пневмококками, гонококками, менингококками, анаэробными клостридиями (возбудителями газовой гангрены), дифтерийными палочками, возбудителями сибирской язвы, спирохетами и многими другими бактериями. Однако при смешанных инфекциях, вызываемых грамотрицательными бактериями, а также при малярии, туберкулезе, вирусных инфекциях, грибковых и некоторых других заболеваниях пенициллин неэффективен. Токсическое действие пенициллина проявляется главным образом в виде аллергических реакций (даже на минимальные дозы) и судорожных припадков (при введении очень больших доз). Список литературы
1. Глущенко Н.Н. и др. Фармацевтическая химия. – М.: Академия, 2004 2. Змушко Е.И., Белозеров Е.С. Лекарственные препараты.- СПб.: Питер, 2000. - 318с. 3. Косарев В.В. Фармакотерапия. – Самара: Медицина. – 1994. – 180с. 4. Фармакологический словарь. / Сост. Фадеева П.М. – М.: Медицина, 2003. 5. Экспериментальные методы химической кинетики. / Под ред. Н.М.Эмануэля, М.Г.Кузьмина. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1985. – С.328-329.